簡(jiǎn)要描述:限制性內(nèi)切酶是一種工具酶,這類酶的特點(diǎn)是具有能夠識(shí)別雙鏈DNA 分子上的特異核苷酸順序的能力,能在這個(gè)特異性核苷酸序列內(nèi),切斷DNA 的雙鏈,形成一定長(zhǎng)度和順序DNA 片段。對(duì)環(huán)狀質(zhì)粒DNA有多少切口,就能產(chǎn)生多少酶切片段,因此鑒定酶切后的片段在電泳凝膠的區(qū)帶數(shù),就可以推斷酶切口的數(shù)目,用已知分子量的線狀DNA 為對(duì)照,從片段的遷移率可以大致判斷酶切片段大小的差別。
酶切鑒定
限制性內(nèi)切酶是一種工具酶,這類酶的特點(diǎn)是具有能夠識(shí)別雙鏈DNA 分子上的特異核苷酸順序的能力,能在這個(gè)特異性核苷酸序列內(nèi),切斷DNA 的雙鏈,形成一定長(zhǎng)度和順序DNA 片段。對(duì)環(huán)狀質(zhì)粒DNA有多少切口,就能產(chǎn)生多少酶切片段,因此鑒定酶切后的片段在電泳凝膠的區(qū)帶數(shù),就可以推斷酶切口的數(shù)目,用已知分子量的線狀DNA 為對(duì)照,從片段的遷移率可以大致判斷酶切片段大小的差別。
酶切鑒定操作步驟
1.培養(yǎng)細(xì)菌
將帶有質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α接種在LB 瓊脂培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)24~48h。
2.從細(xì)菌中快速提取制備質(zhì)粒DNA。
3.質(zhì)粒DNA 的酶解
將自提質(zhì)粒加入20μL 的 TE 緩沖液,使 DNA *溶解。取清潔、干燥、滅菌的離心管編號(hào)用微量加樣器按各種試劑分別加入每個(gè)離心管內(nèi)。
4.DNA酶切加樣要求:
1).選擇合適的酶切位點(diǎn),并找到*緩沖液的酶切Buffer,可保證幾乎100%的酶活性.
2).每小時(shí)10-15U/ul的酶可以酶切1ug的質(zhì)粒DNA,按照比例計(jì)算酶的使用量,酶量的加倍,可適當(dāng)減少酶切時(shí)間。
3).質(zhì)粒DNA的量通常在反應(yīng)體系中擴(kuò)大10倍量,確保酶切*。1小時(shí)內(nèi),50μl反應(yīng)體積中,降解1μg的底物DNA所需的酶為一個(gè)活力單位。因此酶:DNA的反應(yīng)比例可以由此確定。較小的反應(yīng)體積更容易受到移液器誤差的影響。為了將甘油的濃度控制在5%以下,要注意酶的體積不要超過總體積的10%(一般酶都貯存于50%的甘油中)。
4).有的酶要求100μg/ml的BSA以實(shí)現(xiàn)*活性。在這種情況下,我們也相應(yīng)提供100X的BSA(10mg/ml)。不需要BSA的酶如果加了BSA也不會(huì)受太大影響。
5).補(bǔ)無菌雙蒸水至相應(yīng)體系,依實(shí)際情況做相應(yīng)調(diào)整,加樣后,小心混勻,置于37℃水浴中,酶解2~3h,反應(yīng)終止后,各酶切樣品于冰箱中貯存?zhèn)溆谩?br />5.DNA 瓊脂糖凝膠電泳
(1)瓊脂糖凝膠的制備:稱取0.6g 瓊脂糖,置于三角瓶中,加入50 mL TBE 緩沖液,經(jīng)微波爐加熱全部融化后,取出搖勻,此為1.2%的瓊脂糖凝膠。
(2)膠板的制備:將冷卻至65℃左右的瓊脂糖凝膠液,小心倒入凝膠液,使膠液緩慢展開,直到在整個(gè)玻璃板表面形成均勻的膠層,室溫下靜置30 min,待凝固*后,輕輕拔出樣品槽模板,在膠板上即形成相互隔開的樣品槽。
(3)加樣:用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品小槽內(nèi)。每次加完一個(gè)樣品,要用蒸餾水反復(fù)洗凈微量加樣器,以防止相互污染。
6. 電泳
加完樣品后的凝膠板,立即通電。樣品進(jìn)膠前,應(yīng)使電流控制在20mA,樣品進(jìn)膠后電壓控制在60~80V,電流為40~50 mA。當(dāng)指示前沿移動(dòng)至距離膠板1~2cm 處,停止電泳。
7、結(jié)果與觀察
在波長(zhǎng)為254nm 的紫外燈下,觀察DNA 存在處顯示出的熒光條帶。